《蒙娜丽莎》达芬奇的著名肖像画作品，它代表了达芬奇的艺术思想。画面描绘了一位恬静端庄的美丽少女，她充满着对生活的喜悦和信心。画家敏捷地抓住少女一瞬间微笑的表情，表现出她微妙的心里活动，给观众以丰富的联想。肖像以柔和的色调、细腻的手法刻画了少女的脸部、颈部和手部。这种甜美的艺术风格和文艺复兴时期对人性的歌颂，以及对女性美的欣赏观念是完全一致的。
《蒙娜丽莎》是意大利最早如此近聚焦描绘人物半身像的肖像画。其画幅不大，画面构图饱满，达·芬奇运用了透视法，使人物形象具有圆雕式的丰满体积。画中平稳端坐在椅子上的蒙娜丽莎呈四分之三面坐姿，椅子位于阳台前方，她的左臂扶放在椅子的扶手上，右臂倚靠住阳台的挡墙，右手十分自然的搭放在左手上，这样的造型强调了被画者的高贵和威仪。戴在头上精致的黑色面纱时常被误认为是悲伤的隐喻，实际上，它是美德的象征。在阳台的两侧有两个不完整的石柱，形成了一个俯瞰风景的“窗口”。
画面上，她优雅地侧坐在阳台的椅子上，背景上空气透视模糊中起伏的远山，蜿蜒的小路，潺潺的流水，使人感到在心灵视野的空间，她永远是无羁的小鸟，在翠林黛水上飞翔。达芬奇使她有明亮的眼睛，纤细的睫毛，垂落在半袒胸口的头发，并按当时的审美观点，女性的眉毛有损眼睛的明净，所以不给她画眉毛。一切都统一在大气的空蒙和荡漾的软流中。为了加强对人物时代特征的明确表现，达芬奇突破中世纪教会认为腹部以下可以引起人的情欲，故禁止人物肖像画到腹部以下的荒谬规定，把人物画到了腹部以下，对中世纪的观点公开表示对抗。蒙娜丽莎衣着朴素大方，具有音乐感的衣褶取代了一般妇女肖像上常见的珠光宝气，以一丝薄纱在额头轻轻撩起，增加着人物的妩媚。她的手被描绘得极为细腻，似乎正传导着一丝温柔的暖流。蒙娜丽莎最不可捉摸之处是从嘴角流露出的一丝微笑。这微笑有人称之为“圣洁的笑”，“妩媚的笑”，也有人称之为“魅力的笑”，甚至有人称之为“邪恶的笑”，蒙娜丽莎的笑成了千古之迷。达芬奇说眼睛是心灵的窗户，透过眼睛可以窥视到人物全部的内心世界。她的微笑、她的眼睛、显示的是新兴资产阶级的自信，宣告的是神权的覆灭，迎来的是一个崭新的世纪。
这幅《蒙娜丽莎》是达芬奇的最高艺术成就，画中塑造的是一位有产阶级的妇女形象，画中背景优美，刻画细致，栩栩如生。人物坐姿端庄，作者使人物的丰富内心感情和美丽的外形达到巧妙的结合，蒙娜丽莎的手柔嫩身材丰腴，充满女性特有的美感。近处的衣服皱着刻画精细，也反映出达芬奇在绘画上的严谨作风。在蒙娜丽莎的脸上，微暗的阴影时陷时现，为她的双眼与唇部披上了一层面纱。而人的笑容主要表现在眼角和嘴角上，达芬奇却偏把这些部位画得若隐若现，没有明确的界线，因此才会有这令人捉摸不定的“神秘的微笑”，也呈现出不可侵犯的尊严。之所以说神秘，是因为不同的观者或在不同的时间去看，感受似乎都不同。有时觉得她笑得舒畅温柔，有时又显得严肃，有时像是略含哀伤，有时甚至显出讥嘲和揶揄。同时，蒙娜丽莎的右手更被称为“美术史上最美的一只手”。
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